Service - DNA-Microarray Analysen (Agilent Plattform)

Prinzip

Microarrays werden zur RNA-Expressionsanalytik verwendet. Hierzu werden bei der Herstellung verschiedene Fängermoleküle (hier Oligonukleotide) in einem definierten Raster auf einem Substrat fixiert. Die Oligonukleotide dienen hierbei als zur Probe komplementäre Fängermoleküle. Nach Zugabe der Probe erfolgt ein Hybridisierschritt über Nacht, in dem zueinander passende Moleküle eine chemische Bindung eingehen. Mittels Fluoreszenzmarkern kann der Array quantitativ ausgelesen werden. Über das erhaltene Fluoreszenzmuster wird, mittels spezieller Software, ein vordefiniertes Gitter gelegt, über welches die Zuordnung der Fluoreszenzpunkte zu ihren jeweiligen Oligonukleotidsonden erfolgt.

Technologie

Die Herstellung der Agilent Microarrays erfolgt nach dem Prinzip einer kontaktfreien Tintenstrahldruckmethode (SurePrint Technologie). Auf eine Glasoberfläche werden auf diese Weise Oligomonomere in kleinen Volumina (Picoliterbereich) abgelegt und so Base für Base 60-mer Sonden synthetisiert.

Agilent Arrays werden auf einen Glasslide gedruckt, der die Größe eines Objektträgers für die Mikroskopie aufweist. Je nach Arraytyp und Sondenanzahl befinden sich 1, 2, 4 oder 8 Arrays auf dem Glasslide, die parallel prozessiert werden.

Agilent bietet verschiedene Arten von Arrays an. Ein überblick findet sich auf der Homepage des Herstellers.

Beim 3´IVT Assay sind die Sonden so gestaltet, dass sie am 3´- Ende des jeweiligen Transkripts platziert sind. Beim WT Assay sind die Sonden über das komplette Transkript verteilt. Der WT Assay wird in verschiedenen Größen/Abdeckungen (Menge an Sonden auf dem Slide) angeboten.

Durchführung

Die Verarbeitung der Proben erfolgt je nach Array-Typ mittels verschiedener Protokolle. Zunächst erfolgt eine Umschreibung der totalRNA in cDNA. Hierzu wird ein T7-Oligo(dT)-Primer verwendet. Während der anschließenden in vitro-Transkription (IVT) wird die entstehende cRNA durch den Einbau von Cy3-dCTP fluoreszenzmarkiert. Anschließend wird die Probe aufgereinigt und quantifiziert. Die Konzentration wird angepasst und eine Fragmentierung durchgeführt.

Nach einem Hybridisierschritt über Nacht wird der Slide gewaschen und anschließend mit dem entsprechenden Scanner ausgelesen. Als Ergebnis erhält man eine 20bit tiff-Datei, aus der mit der entsprechenden Software die Roh-Fluoreszenzwerte extrahiert werden.

Geräte

Zur Prozessierung der Arrays werden im GTL folgende Geräte der Firma Agilent verwendet:

Prozedere/Service

Das GTL bietet Agilent Arrays als full Service an. Dies umfasst die komplette Synthese, das Scannen und einen Qualitätscheck der Proben (Ausgangspunkt: totalRNA). Als Ergebnis erhält der Kunde die Rohdaten zurück (s.o.).
Zusätzlich bieten wir auch einen Teilservice an, bei dem wir die Proben ab der Fragmentierung übernehmen. Dies sollte jedoch aufgrund des Experimentablaufs vorher mit uns in enger Absprache vereinbart werden.

Beim reinen Hybridisier- und Scanservice wird das Material (hauptsächlich die Arrays) von Ihnen gestellt und mitgebracht. Ausnahme hierbei bilden die Reagenzien für die Fragmentierung, welche von uns zum Selbstkostenpreis zur Verfügung gestellt werden können.

Vor der Abgabe von Proben beachten Sie bitte den Punkt: Anforderung an die Proben.

Proben können im GTL Microarray Büro in Geb.23.12.02 Raum 25/29 abgegeben werden. Vergessen Sie bitte den Blockzettel nicht!

Anforderung an die Proben

Die Anforderungen an die Proben richten sich nach dem gewählten Service:

Für den Hybridisier- und Scannservice benötigen wir fertig markierte cRNA, welche anschließend von uns fragmentiert und hybridisiert wird. Die Vorgehensweise dazu findet sich in den Protokollen für die verschiedenen Assays.
Beim full-service starten wir als Ausgangsmaterial mit totalRNA, welche uns von Ihnen zur Verfügung gestellt wird. Eine qualitative Analyse Ihrer totalRNA bieten wir ebenfalls an. Die benötigte Menge richtet sich wiederum nach der Art des Assays:

3´- IVT Expression: 10 – 200 ng; empfohlen werden 100 ng
WT – Assay (Exon Array): 25 – 100 ng; empfohlen werden 100 ng
miRNA Assay: 100 ng

Anmerkungen zur Planung eines Array Experiments

Entscheidend für ein erfolgreiches Array Experiment ist die Qualität der eingesetzten totalRNA. Diese sollte möglichst hochwertig und innerhalb der einzelnen Proben möglichst vergleichbar sein. Eine Möglichkeit zur Qualitätsbestimmung bietet die Bioanalyzer-Analyse. Diese vergibt für jede RNA einen standardisierten Qualitätswert von von 1 – 10 (RIN, RNA Integrity Number).

Bei der Planung des Experiments sollten biologische Replikate für die einzelnen Konditionen vorgesehen werden. Wir empfehlen ein Minimum von 3 Replikaten pro zu untersuchender Kondition. Auf diese Weise erhält man zum einen eine robustere Statistik und ist zum anderen gegenüber möglichen Hybridisierausfällen geschützt.

Microarray Experimente sollten dem MIAME Standard entsprechen (Minimum Information About a Microarray Experiment). Weitere Informationen finden Sie hier:

Ansprechpartner:


(0211) 81 - 1 04 75


(0211) 81 - 1 43 67

Links: