Service - DNA-Microarray Analysen (Affymetrix Plattform)

Prinzip

Microarrays werden zur RNA-Expressionsanalytik verwendet. Hierzu werden bei der Herstellung verschiedene, zur Probe komplementäre Fängermoleküle (hier Oligonukleotide) in einem definierten Raster auf einem Substrat fixiert. Nach Zugabe der Probe erfolgt ein Hybridisierschritt über Nacht, in dem zueinander passende Moleküle eine chemische Bindung eingehen. Mittels Fluoreszenzmarkern kann der Array quantitativ ausgelesen werden. über das erhaltene Fluoreszenzmuster wird, mittels spezieller Software, ein vordefiniertes Gitter gelegt, über welches die Zuordnung der Fluoreszenzpunkte zu ihren jeweiligen Oligonukleotidsonden erfolgt.

Technologie

Die Herstellung der Affymetrix Microarrays erfolgt nach dem Prinzip der Photolithographie. An einer festen Phase befinden sich Linker-Moleküle, die mit einer photolabilen Gruppe am Ende versehen sind. Über spezielle Masken wird gesteuert welche der Schutzgruppen, durch Einstrahlung von Licht abgespalten werden. An den nun freigewordenen Bindestellen kann das entsprechende Nukleotid angekoppelt werden, welches wiederum mit einer photolabilen Schutzgruppe am anderen Ende versehen ist. Durch Wiederholen dieses Vorgangs und aktiver Steuerung der Schutzgruppenabspaltung werden 25mer-Sonden auf das Substrat synthetisiert. Affymetrix Arrays befinden sich nach der Fertigstellung in einer Plastikkartusche, die auf der Vorderseite ein Fenster aufweist, über das die Arrays ausgelesen werden können. Auf der Rückseite befinden sich zwei Septen, über die die Probe eingefüllt wird. Eine Kartusche enthält jeweils einen Array.

Affymetrix bietet verschiedene Arten von Arrays an. Ein Überblick findet sich auf der Homepage des Herstellers.
Am häufigsten werden im GTL die 3´IVT Expression Arrays, die Whole Transkript Expression Arrays und die miRNA Analysis Arrays prozessiert. Beim 3´IVT Assay sind die Sonden so gestaltet, dass sie das 3´- Ende des jeweiligen Transkripts abdecken. Beim WT Assay sind die Sonden über das gesamte Transkript verteilt. Hierbei unterscheidet Affymetrix zwischen Exon Arrays und Gene Arrays. Bei den Exon Arrays wird das gesamte Transkript abgedeckt. Es befinden sich pro Gen 40 Sonden auf dem Array. Mit dem Exon Array können sowohl Expressionsdaten gewonnen, als auch Aussagen über alternatives Splicing getroffen werden. Die Gene Arrays sind eine "abgespeckte" Version der Exon Arrays und wurden aus einem Subset der o.g. Sonden gebildet, wobei man sich hierbei nur auf die gut annotierten Bereiche des Organismus konzentriert hat. Zur Untersuchung von microRNA dienen die miRNA Analyses Micorarrays.

Als kostengünstige 3´IVT Expression Alternative für humane Expressionsstudien bietet Affymetrix nun einen sogenannten PrimeView Array an. Dieser ist eine abgespeckte Variante des U133 Plus 2.0 Arrays.

Durchführung

Die Verarbeitung der Proben erfolgt je nach Array-Typ mittels verschiedener Protokolle. Zunächst erfolgt eine Umschreibung der totalRNA in cDNA. Beim 3´-IVT-Assay wird dazu ein T7-Oligo(dT)-Primer verwendet. Während der anschließenden in vitro-Transkription (IVT) wird biotinyliertes Uracil in die amplifizierte cRNA eingebaut.

Beim WT – Assay wird die nach der IVT entstandene cRNA mittels Random Primern und einem dUTP/dNTP Nukleotidmix in cDNA umgeschrieben. Nach dem Abtrennen des cRNA-Strangs durch RNase H und einem Waschschritt wird die nun einzelsträngige cDNA mit Uracil DNA Glycosylase fragmentiert, welche den Strang am eingebauten Uracil schneidet. Am 3´- Ende der Fragmente wird im selben Schritt eine Biotinylierung vorgenommen.

Nach einem Hybridisierschritt über Nacht wird der Array gewaschen und gefärbt. Die Färbung erfolgt über einen Farbstoff, der an Streptavidin gekoppelt ist. Nach der Färbung wird der Array mittels eines Scanners ausgelesen. Als Ergebnis erhält man Rohdaten folgender Formate:

*.jpg File => enthält die Informationen des gescannten Bilds
*.DAT => enthält die Intensitätswerte der einzelnen Pixel des gescannten Bilds
*.CEL => enthält die Intensitätswerte für die einzelnen Sonden auf dem Array, berechnet aus dem DAT-File. Das *.CEL File wird in der Regel zur Auswertung der Daten verwendet

Geräte

Bild eines Affymetrix-Scanner

Affymetrix-Scanner des GTL

Bild eines Affymetrix-Scanner

Zur Prozessierung der Arrays werden im GTL folgende Geräte der Firma Affymetrix verwendet:

Prozedere/Service

Das GTL bietet verschiedene Serviceleistungen für Affymetrix Arrays in Kartuschen an. Diese reichen von einem einfachen Hybridisier- und Scanservice (Ausgangspunkt: vom Kunden nach Protokoll fragmentiertes Material) bis zu einer kompletten Synthese (full service) der Proben (Ausgangspunkt: totalRNA). Als Ergebnis erhält der Kunde die Rohdaten s.o..

Beim reinen Hybridisier- und Scanservice wird das Material (hauptsächlich die Arrays) von Ihnen gestellt und mitgebracht. Ausnahme hierbei bilden die Kontroll-Oligos und das „Hybridisation, Wash and Stain Kit”, welche, zu den unten genannten Preisen, auch von uns bereitgestellt werden können. Dies hat für Sie den Vorteil, dass Sie nur die Proben bezahlen müssen, die Sie auch wirklich prozessieren. Über Affymetrix sind nur Kits für jeweils 30 Arrays zu beziehen, unabhängig von der eigentlich benötigten Menge an Arrays. Wenn Sie das „Hybridisation, Wash and Stain Kit” trotzdem selber stellen wollen, dann bitten wir Sie, dieses nach dem Service wieder abzuholen, da wir nicht den nötigen Lagerplatz für eine dauerhafte Aufbewahrung zur Verfügung stellen können.

Vor der Abgabe von Proben beachten Sie bitte den Punkt: Anforderung an die Proben.

Proben können im GTL Microarray Büro in Geb.23.12.02 Raum 25/29 abgegeben werden. Vergessen Sie bitte den Blockzettel nicht!

Auswertungen von Arraydaten bieten wir nur im Rahmen einer Kooperation an, da dies von uns als definierter Service nicht geleistet werden kann. Zur Auswertung von Arrays im Rahmen von Kooperationsprojekten stehen uns verschiedene Softwarepakete kommerzieller und nicht kommerzieller Art (GeneSpring, Partek Genomic Suite, R) zur Verfügung. Gerne unterstützen wir Sie bei der Auswahl der geeigneten Plattform/des geeigneten Arrays sowie bei der Planung der Experimente. Der letztgenannte Punkt ist uns gerade im Hinblick auf eine möglichst effektive Datenauswertung ein besonderes Anliegen.

Sollten Sie Interesse an einer Kooperation haben, so nehmen Sie doch bitte Kontakt mit uns auf.

Anforderung an die Proben

Die Anforderungen an die Proben richten sich nach dem gewählten Service:

Für den Hybridisier- und Scannservice benötigen wir fertig fragmentierte cRNA. Die Vorgehensweise dazu findet sich in den Protokollen für die verschiedenen Assays.
Beim full-service starten wir als Ausgangsmaterial mit totalRNA, welche von Ihnen zur Verfügung gestellt wird. Eine qualitative Analyse Ihrer totalRNA bieten wir ebenfalls an. Die benötigte Menge richtet sich wiederum nach der Art des Assays:

3´- IVT Expression: 50 – 500 ng; empfohlen werden 100 ng
WT – Assay (Gene und Exon Array: 50 – 500 ng; empfohlen werden 100 ng
miRNA Assay: 100 – 1000 ng von Gewebe, 500 – 1000 ng für Zellkulturen

Anmerkungen zur Planung eines Array Experiments

Entscheidend wichtig für ein erfolgreiches Array-Experiment ist die Qualität der eingesetzten totalRNA. Diese sollte möglichst hochwertig und innerhalb der einzelnen Proben möglichst vergleichbar sein. Eine Möglichkeit zur Qualitätsbestimmung bietet die Bioanalyzer-Analyse. Diese vergibt für jede RNA einen standardisierten Qualitätswert von 1 – 10 (RIN, RNA Integrity Number).

Bei der Planung des Experiments sollten biologische Replikate für die einzelnen Konditionen vorgesehen werden. Wir empfehlen ein Minimum von 3 Replikaten pro zu untersuchender Kondition. Auf diese Weise erhält man zum einen eine robustere Statistik und ist zum anderen gegenüber möglichen Hybridisierausfällen geschützt.

Microarray Experimente sollten dem MIAME Standard entsprechen (Minimum Information About a Microarray Experiment). Weitere Informationen finden Sie hier:

Ansprechpartner:


(0211) 81 - 1 04 75


(0211) 81 - 1 43 67

Links: